隨著新冠疫情的發展，在新冠疫苗的研發中，疫苗接種機體後能否有效避免無症狀感染和抑制病毒的再傳播逐漸受到重視，其中的一個關鍵就是能否有效激活CD8⁺ T細胞反應，實現細胞免疫應答，清除被病毒感染的細胞。尤其是在病毒不斷變異的情況下，細胞免疫的識別序列保守性以及長期的記憶性特點有希望實現廣譜的抗感染效果。因此，新冠刺突蛋白（S）的保守CD8⁺ T細胞表位一直是科學家和疫苗研發人員的尋找目標。


近日，艾棣維欣生物製藥團隊及復旦大學等合作單位在該領域有了重要的研究發現，相關發現為評估疫苗免疫後由CD8+ T細胞介導的免疫反應提供了工具，也為研發出更加有效和廣譜的新冠疫苗提供了新的靶點和思路。經過進一步的深入分析發現，該表位肽序列不僅在已知野生型、VOC和VOI的突變株中高度保守，在目前新出現的Omicron變異株中仍然高度保守。

在線期刊《BioRxiv》發表的名為Identification of a promiscuousconserved CTL epitope within the SARS-CoV-2 spike protein 的文章，詳細展示了相關的研究發現：

• 覆蓋新冠病毒Spike蛋白中NTD和RBD區域的重疊氨基酸多肽庫（Pool 1）具有較強的CTL表位活性；

• 在重疊氨基酸多肽庫（Pool 1）中，發現一段具有較強CTL表位功能的多肽（Peptide 2），這段多肽在目前SARS-CoV-2各種流行變異株中高度保守，與世界上大多數人群的HLA等位基因相兼容。

  

多肽庫Pool 1中存在具有較強
CD8+ CTL表位活性的多肽

研究利用BALB/c小鼠動物模型，經過可在體內表達SARS-CoV-2刺突蛋白的pGX9501新冠DNA疫苗兩劑次免疫，通過ELIspot實驗發現：相較於對照組S2蛋白的重疊氨基酸多肽庫（Pool2），使用Pool 1刺激淋巴細胞後新冠抗原特異性IFN-γ的表達量顯著升高（圖1）。同時，體內CTL實驗顯示，Pool 1在體內能夠激發強烈的CTL細胞反應（圖2）。這些結果表明，在多肽庫Pool 1中存在著MHC-I表位。

圖1：ELISpot檢測多肽庫體外刺激pGX501免疫後

BALB/c小鼠淋巴細胞分泌IFN-γ的水平

圖2：體內CTL殺傷實驗，相對於對照空載體pVAX1和野生型pVAX1-S-WT DNA疫苗免疫組，Pool 1檢測出pGX9501免疫的小鼠顯著的抗原特異性CTL反應

鑒定出多肽庫Pool 1中存在的一段具有較強MHC-I表位功能的多肽Peptide2

通過IEBD表位在線分析，研究團隊對肽庫Pool 1中的氨基酸序列進行分析。同時，為提高預測的準確性，分析過程還採用了H-2d MHC-I等位基因的MHC-I親和力預測、MHC-I免疫原性預測以及MHC分子天然加工（MHC-NP）預測這三種方法。根據不同等位基因條件下各種預測方案下的得分，找出了Peptide2、11、12這三個多肽可能具有較強的MHC-I表位功能（如圖3及原文數據）。

图3：IEBD表位在线分析预测结果，A为免疫原性

评分，B为TAP结合功能评分

通過ELIspot實驗，對IEBD預測評分高的多肽是否具有強MHC表位功能進行驗證。結果表明Peptide2相較於其他兩種多肽，能夠刺激出更高的IFN-γ產生（圖4A）。進一步研究發現Peptide 2激活的是CD8+ T細胞而非CD4+ T細胞（圖4B）。根據H-2d MHC-I等位基因的偏好性預測Peptide2中的錨定氨基酸位點，然後將這些位點進行突變，驗證結果表明不僅IEDB分析的親和力分值顯著下降（表1），且刺激CD8+ T細胞分泌IFN-γ的水平也顯著降低（圖5）。

圖4：ELISpot實驗評價候選多肽的功能。圖A比較了Pool1中不同的多肽片段體外刺激IFN-γ分泌的情況；圖B驗證了多肽分別刺激CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌IFN-γ的水平

表1：IEBD比較Peptide2及氨基酸序列突變後的
Peptide2與MHC-I分子的親和性

圖5：ELISpot實驗比較Peptide2及氨基酸序列突變後的Peptide2體外刺激淋巴細胞分泌IFN-γ的水平

Peptide 2序列高度保守，且與世界上
大多數人群HLA等位基因相兼容

研究比對了Peptide 2氨基酸序列與WHO公佈的SARS-CoV-2多種突變株，包括關切變異株（VOC）和關注變異株（VOI）在內的多種突變毒株序列，均發現Peptide 2序列高度保守（如圖6A），位於刺突蛋白NTD區域末端及RBD上游（圖6B）。這種高度保守的表位序列為評估疫苗免疫後CD8+介導的免疫反應提供了重要的工具。

圖6：A圖顯示Peptide 2 (黃色)與突變株序列比對；B圖顯示Peptide 2（黃色）在刺突蛋白結構中的位置

由於MHC-I基因在全球範圍不同人群中存在遺傳學上的差異和多樣性特點，同一抗原多肽表位序列可能被某地區的人群MHC-1分子識別，但無法被其他群體識別或者識別能力很低，從而限制了其表位的廣譜性的應用。為分析Peptide 2是否可以被世界範圍內大多數群體識別，該研究對不同區域人群中27個主流的MHC-1型分子等位基因（Human Leukocyte Antigen, HLA）進行分析（圖表見原文）。經過對Peptide 2與這些分子相互作用的評估，針對其與HLA親和力、免疫原性以及TAP潛力的預測評分，結果顯示Peptide 2表位可以被 HLA-A*02:01 （歐美地區）， HLA-B*08:01（歐洲及澳大利亞地區），HLA-A*23:01（北非和撒哈拉以南的非洲，HLA-A*02:03（東南亞地區），HLA-A*24:02（大洋洲），HLA-A*02:06 （北非、東南亞及大洋洲），HLA-A*33:01 （中國和巴基斯坦），HLA- B*35:01（大洋洲） 以及HLA-A*03:01 （歐洲）識別，顯示出了Peptide 2的廣譜兼容性。

可以看出，在SARS-CoV-2病毒刺突蛋白中涵蓋NTD和RBD區域的重疊多肽庫中發現的這種具有與MHC-I高親和且序列保守，同時兼容世界上大多數人群HLA等位基因的表位序列（Peptide 2），該表位有望成為評估疫苗免疫後CD8+ T細胞介導的免疫反應的重要工具，以及有望成為開發更有效廣譜的新冠疫苗候選產品的潛在靶標。

艾棣維欣是一家創新疫苗公司，依託成熟的內部技術平台開發了高價值預防性及治療性疫苗管線，並具備工業化生產能力。艾棣維欣的關鍵在研產品管線包括針對新型冠狀病毒 (SARS-CoV-2)、呼吸道合胞病毒 (RSV) 及乙肝病毒 (HBV) 引起疾病的潛在首創疫苗，這些疾病均為醫療需求遠未得到滿足的疾病。艾棣維欣也正在開發涉及一系列癌症疫苗，包括病毒相關腫瘤的候選疫苗、基於腫瘤新抗原 (Neo-Antigen) 的治療性疫苗及腫瘤相關抗原 (TAA) 的治療性疫苗

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